Ekspresyon Array Hakkında Bilmeniz Gerekenler
Kullanılabilir Materyaller:
Ekspresyon Array Hayvan çipleri: Human, mice, rat, bovine, canine, chicken, C.elegans, drosophila, horse, mosquito, rhesus macaque, rabbit, salmon, sheep, xenopus, zebrafish, porcine
Ekspresyon Array Bitki Çipleri: Arabidopsis, barley, brassica, cotton, medicago, rice, tobacco, tomato, wheat
Ekspresyon Array Diğer Organizmalar: E.coli, magnaporthe, yeast,
miRNA Array Çipleri: Human, mouse, rat
Ekspresyon Array Veri Analiz Basamakları
1. Ham Veri
Ham veri ile proje oluşturulması
Eski veri varsa veri entegrasyonu
2. Veri Kalite Kontrolü
Filtreleme
Normalizasyon
Batch effect düzeltmesi
Scatter grafiği
Seviye grafiği
Korelasyon heatmap
Box grafiği
Yoğunluk grafiği
PCA Grafiği
Filtrelenmiş veri özeti
3. Veri Analizi
Temel İstatistik
Ekspresyon seviye dağılım grafikleri
Ortalama sinyal scatter grafiği
Anlamlı artan/azalan bar grafiği
t-test (Bağımsız veya eşli)
Anlamlı FC&pval bar grafiği
Volcano grafiği
1-way ANOVA
2-way ANOVA
Çoklu test doğrulaması
Hiyerarşik Kümeleme (Cluster) Analizi
Heatmap
Dendrogram
K-means kümeleme
Line grafiği
Heatmap
4. Fonksiyonel Analizler
Ek Anotasyonlarlar
KEGG, DAVID, wikipathway yolak araması
Gen Ontoloji (GO) Analizi
Gentera Biyoteknoloji deney dizaynınızı kontrol ederek, örnek sayınıza ve çalışmanıza en uygun teknolojiyi önerir. Metodunuzu belirler ve çalışmalarınız için kullanacağınız malzemeleri en uygun fiyatlarda tedarik etmenizi sağlar.
Deney planlaması yapılırken dikkat edilecek önemli bir nokta deney şartlarının tüm örnekler için aynı olmasıdır. Kullanılan RNA izolasyon kiti, materyalin saklama koşulları, hedef ve kontrollerin yaşı, cinsiyeti vs. durumlar sonuçları etkilemektedir.
Önemli bir diğer nokta, gruplarda yer alacak replikalardır. Yeni nesil teknolojilerde internal kontroller fazla olduğu için teknik replika kullanımına gerek görülmemektedir. Teknik replika terimi, aynı örneğin birden fazla kez çalışılmasıdır. Örneğin Illumina Ekspresyon Array çiplerinde her bir probe’un 9 kopyası vardır. Bu tür çalışmalarda teknik replika yerine biyolojik replika kullanılması önerilmektedir. Biyolojik replika, aynı grupta, aynı uygulamalardan geçmiş örneklerdir. Biyolojik replikalar oluşturulurken, grupların homojenitesi, verilerinizin kalitesini ve sonuçların anlamlılığını arttırır. Çalışmanızın detaylarına bağlı olmakla birlikte, homojen gruplarda en az 3 örnek kullanılmalıdır. Bu sayının artması deney hassasiyetini arttırır. Çalışma etkilerinin gücüne, grupların çeşitliliğine ve teknik kirlilik seviyelerine bağlı olarak değişir.
Pooling yöntemi, materyalin elde edilmesinin zor olduğu durumlarda önerilmektedir. Örnek homojenitesini bozduğu için normal şartlarda kullanılmaz.
Hücre kültürü ve hayvan modeli çalışmalarında grup içindeki örnekler daha homojen olduğu için her grupta 3 örnek yeterli olmakladır. Knock-out farelerin yabanıl tip farelerle karşılaştırılması, homojen biyolojik replika çalışmasına uygun bir örnektir. Benzer bir şekilde, farklı ilaç uygulamaları yapılan kanser hücre soylarının karşılaştırılması, veri kalitesi ve sonuçların anlamlılığı açısından son derece uygun çalışmalardır. En yaygın kullanılan deney dizaynı, hasta örnekleri ile sağlıklı kontrollerin karşılaştırılmasıdır. Hasta çalışmalarında bireyler arası çeşitlilik fazla olduğu için gruplardaki örnek sayılarının arttırılması gerekmektedir.
Farklı organizmalar, dokular veya hücreleri birbirleriyle karşılaştırmak uygun değildir. Bunun nedeni, farklı organizmalarda bulunan genlerin ve gen ürünlerinin aralarında farklılıklar bulunmasıdır. Aynı organizmanın, aynı dokularında bile farklı hücre tipleri bulunabilmektedir. Bu durum hem gen ekspresyonu çalışmalarında, hem de dizi analizi çalışmalarında sorunlar yaratmaktadır.
Ekspresyon Array çalışmanızın sonuçlarına göre seçeceğiniz genleri Real-time PCR ile doğrulamanızı öneririz. Real-time PCR, mikroarray platformuna göre daha hassas ölçüm yapabilir ve hedefli gen çalışmalarına daha uygundur. Fakat mikroarray gibi genom boyu taramaya fiyat ve çalışma süresi olarak uygun değildir.
miRNA Array çalışmalarında total RNA kullanılmaktadır. Çalışmanın dizaynı ve deneysel basamakları benzemekle beraber, analizi sırasında önce “Targeted Genes” analizi yapılır. Daha sonra miRNA’ların hedeflediği bu genler üzerinden analiz tamamlanır. Kullanılan çipler miRBase v20 veritabanının tamamını kapsar.
Örnek Kabul Koşullarımız
RNA örneklerinizin miktarı ve kalitesi, çalışmalarınız sonucunda elde edeceğiniz verilere direkt etki eder. Biz çalışmalarımız için 25 µl hacminde ve minimum 100 ng/µl konsantrasyonunda RNA örnekleri kullanmaktayız. RNA absorbans değerleri A260/280 için 1,8-2,0 aralığında ve A260/230 için 2,0’den yüksek olmalıdır.
